Εμβάθυνση της ανάλυσης τροφιμογενών βακτηρίων στις μονάδες επεξεργασίας ή και στο χωράφι
Οι παραγωγοί τροφίμων, οι μεταποιητές και οι διανομείς προσβλέπουν σε ταχύτερα τα αποτελέσματα των μικροβιακών αναλύσεων, ώστε να προωθήσουν τα εμπορεύματά τους στις αλυσίδες εφοδιασμού.
Για την κάλυψη αυτής της ζήτησης, οι εταιρείες αναπτύσσουν και εμπορεύονται απλές, φιλικές προς το χρήστη δοκιμές που μπορούν να πραγματοποιηθούν στη μονάδα επεξεργασίας ή στο χωράφι από σχετικά ανεκπαίδευτο προσωπικό. Έτοιμες να αντικαταστήσουν τις μεθόδους που χρησιμοποιούν καλλιέργειες και μοριακό έλεγχο, οι αναλύσεις που βασίζονται στον βιοαισθητήρα χρησιμοποιώντας συγκεκριμένους βιοδείκτες όπως νουκλεϊκά οξέα, πρωτεΐνες, αντιγόνα και μεταβολικά προϊόντα, είναι το τρίτο κύμα συστημάτων μικροβιακής ανίχνευσης. Αυτά τα κιτ και οι μορφές βιοαισθητήρα, στοχεύουν στην απαίτηση της βιομηχανίας τροφίμων για γρήγορη και φθηνή παρακολούθηση της ασφάλειας και της ποιότητας, ώστε να αποδεσμευθεί το προϊόν.
Αλλά πριν η βιομηχανία τροφίμων κάνει περικοπές στους προϋπολογισμούς των αναλύσεων, τα ενδιαφερόμενα μέρη θα πρέπει να εξετάσουν μια αλλαγή στην ασφάλεια των τροφίμων και τη γεωργική έρευνα: Οι μικροβιακές δοκιμές πρέπει να πηγαίνουν όχι μόνο ταχύτερα αλλά και βαθύτερα.
Οι μέθοδοι καλλιέργειας, δυστυχώς, έχουν σημαντικά μειονεκτήματα για τον εντοπισμό όλων των μεμονωμένων ειδών σε μια μικροβιολογική κοινότητα. Δεν θα αναπτυχθούν όλα τα μικρόβια σε εργαστηριακό περιβάλλον και ορισμένοι κατεστραμμένοι ή στρεσαρισμένοι μικρο-οργανισμοί μπορεί να είναι βιώσιμοι αλλά όχι καλλιεργήσιμοι. Οι μέθοδοι καταμέτρησης αποικιών δεν μπορούν αξιόπιστα να απαριθμήσουν ή να αναγνωρίσουν μικροβιακά κύτταρα όπως τα σπόρια, τα οποία τείνουν να συσσωρεύονται όταν τοποθετούνται στα τρυβλία. Τα διάφορα υλικά τροφίμων, προσφέρουν μια πρόκληση για τις μεθόδους καλλιέργειας. Είναι γνωστό ότι τα μπαχαρικά, τα βότανα, η σοκολάτα και τα προμείγματα βιταμινών και ανόργανων συστατικών, αναστέλλουν τη μικροβιακή ανάπτυξη και προκαλούν σύγχυση την ανάγνωση των αποικιών.
Η βαθιά ανάλυση με αλληλουχία (sequencing) παρακάμπτει τους καλλιεργητικούς περιορισμούς στοχεύοντας απευθείας σε νουκλεϊκά οξέα όπως το DNA και το RNA για ταυτοποίηση. Η ανακάλυψη και η καταγραφή της ποικιλομορφίας των παθογόνων οροτύπων και στελεχών, μικροβίων, βιοϋμενίων και άλλων μικροβιακών κοινοτήτων, μπορεί να βοηθήσει στην πρόληψη ανακλήσεων, στον μετριασμό των κρουσμάτων, στην παροχή βοήθειας για την ανακάλυψη ανθεκτικών στα αντιμικροβιακά μικροβίων και να επισημάνει τις αλλαγές ως προς τους επιμολυντές, τη συνταγή ή το περιβάλλον.
Το sequencing έχει επίσης γίνει μια πιο προσιτή και προσβάσιμη ανάλυση. Η αλληλουχία του συνολικού DNA και του συνολικού RNA εγκαταλείπει τη σφαίρα των ακαδημαϊκών και κινείται στη βιομηχανία. Νέες τεχνολογίες, όπως το CRISPR-SeroSeq παρέχουν βαθύτερες πληροφορίες.
Οροτυποποίηση Salmonella, βασισμένη σε καλλιέργεια
Οι περισσότερες οροτυποποιήσεις έχουν περιοριστεί σε προσεγγίσεις που βασίζονται στην καλλιέργεια και ανιχνεύουν μόνο τους πιο πολυάριθμους ή υπαίτιους ορότυπους ή στελέχη. Μια πρόσφατη μελέτη, ωστόσο, διαπίστωσε ότι το 91% των δειγμάτων που ελήφθησαν από πτηνοτροφεία και εγκαταστάσεις επεξεργασίας, φιλοξενούν περισσότερους από έναν ορότυπους, με μελέτη να έχει δείξει πως έχουν βρεθεί σε ένα μόνο σφάγιο κοτόπουλου κρεατοπαραγωγής μέχρι και εννέα.
Στατιστικά μιλώντας, έξι αποικίες θα πρέπει να συλλεχθούν και να οροτυποποιηθούν για να εξασφαλιστεί μια πιθανότητα 95% να εντοπιστούν δύο ορότυποι, αλλά αυτή η πιθανότητα ισχύει μόνο εάν και οι δύο ορότυποι είναι ισάριθμοι στο δείγμα. Εάν ένας από τους ορότυπους υπερτερεί αριθμητικά 10:1 από έναν άλλο, θα χρειαστούν τουλάχιστον 32 αποικίες για να ανακαλυφθεί αυτός που έχει την μειονότητα.
Σύνθετη οροτυποποίηση Salmonella
Η ανακάλυψη των ομαδοποιημένων τακτικά διασταυρούμενων σύντομης παλινδρομικής επανάληψης συστημάτων (CRISPR)-Cas, έχει φέρει την επανάσταση στην επεξεργασία DNA μέσω ακριβούς στόχευσης, κοπής και συνένωσης των στοχευμένων γονιδίων με τα ζωντανά κύτταρα. Το CRISPR-Cas βρίσκεται στο 45% περίπου των αλληλουχιών βακτηριακών γονιδιωμάτων. Οι συστοιχίες CRISPR περιέχουν εξαιρετικά μεταβλητές ακολουθίες spacer που περιβάλλονται από σχετικά σταθερές αμετάβλητες επαναλαμβανόμενες ακολουθίες. Οι περιοχές spacer, είναι σύντομα τμήματα του ξένου DNA που αποκτήθηκαν όταν το σύστημα Salmonella CRISPR-Cas προστάτευε ενεργά το κύτταρο από την εισβολή βακτηριοφάγων.
Τα είδη Salmonella έχουν δύο συστοιχίες, που ονομάζονται CRISPR1 και CRISPR2, οι οποίες έχουν αποδειχθεί ότι έχουν ξεχωριστές περιοχές spacer, ειδικές για κάθε ορότυπο. Αυτές οι περιοχές μπορούν να ενισχυθούν από τα καθολικά primers (εκκινητές) της PCR με βάση τις αμετάβλητες επαναλαμβανόμενες ακολουθίες. Μετά το sequencing, οι πληροφορίες του DNA μπορούν να συγκριθούν με μια αυξανόμενη βάση δεδομένων που προσδιορίζει τον ορότυπο. Το όνομα αυτού του καινοτόμου μοριακού εργαλείου που μπορεί να διερευνήσει το βάθος της ποικιλίας των οροτύπων στο 0,01% του δείγματος, είναι Crispr-SeroSeq.
Οι συστοιχίες CRISPR της Salmonella μπορούν να χρησιμοποιηθούν, επειδή οι ερευνητές παρατήρησαν ότι αυτά τα βακτήρια δεν προσαρμόζονται πλέον στην επίθεση φάγων αποκτώντας νέες περιοχές spacer. Οι γονιδιωματικές ακολουθίες σε αυτή την περιοχή ενδιαφέροντος είναι σταθερές, αλλά το πιο σημαντικό, διαφέρουν μεταξύ διαφορετικών οροτύπων.
“Στόχος μας είναι ότι η χρήση του CRISPR-SeroSeq θα μας δώσει περισσότερο χρόνο για να μετριάσουμε μια πιθανή τροφιμογενή επιδημία Salmonella”, λέει στο IFT η Nikki Shariat, επιστήμονας στο Διαγνωστικό και Ερευνητικό Κέντρο Πουλερικών του Πανεπιστημίου της Georgia και επικεφαλής προγραμματιστής της δοκιμασίας. “Παρακολουθώντας τις εγκαταστάσεις παραγωγής και επεξεργασίας, μπορούμε να ανιχνεύσουμε ορότυπους που αυξάνονται, πολύ πριν μπορέσουμε να τραβήξουμε τις αποικίες από ένα τρυβλίο (πιατάκι). Ελπίζουμε ότι αυτό θα μας επιτρέψει να προβλέψουμε ένα ξέσπασμα πριν γίνει πρόβλημα”.
Οι βακτηριακές κοινότητες είναι πολύπλοκες και εξελίσσονται συνεχώς λόγω των αλλαγών στο περιβάλλον, των διαθέσιμων υποστρωμάτων ανάπτυξης και άλλων παραγόντων όπως η ενεργότητα ύδατος και το pH. Με την πάροδο του χρόνου, ορισμένα μικρόβια τείνουν να υπερισχύουν και να γίνονται πιο πολλά. Αυτό το προγνωστικό σύστημα μπορεί επίσης να είναι χρήσιμο στην παροχή έγκαιρης προειδοποίησης όταν ένας εξαιρετικά λοιμώδης ή ανθεκτικός στα αντιβιοτικά ορότυπος αυξάνεται.
Για παράδειγμα, μια μελέτη CRISPR-SeroSeq που εξέτασε δείγματα περιττωμάτων βοοειδών βρήκε ένα μειονοτικό ορότυπο, το Salmonella Reading, που ήταν ανθεκτικό στην τετρακυκλίνη. Ευτυχώς, οι άφθονοι ορότυποι στα κόπρανα βοοειδών ήταν ευαίσθητοι στο αντιβιοτικό. Ωστόσο, αυτή η γνώση μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον μετριασμό της αύξησης και της επικράτησης του ανθεκτικού στην τετρακυκλίνη στελέχους.
Το CRISPR-SeroSeq είναι επίσης πιο οικονομικό από τα metagenomics, επειδή το CRISPR-SeroSeq μπορεί να πολλαπλασιάζει πολλά δείγματα σε μία μόνο διαδρομή αλληλουχίας. Αυτό μειώνει σημαντικά το κόστος αλληλουχίας και καθιστά πιο ελκυστική την παρακολούθηση της ποικιλομορφίας των οροτύπων Salmonella με την πάροδο του χρόνου.
Από την αρχική δημοσίευση της μεθόδου, η βάση δεδομένων έχει αυξηθεί από 109 σε 130 οροτύπους, σύμφωνα με την Shariat.
Μετατοπίσεις Μικροβιώματος
Ιατρικές έρευνες έχουν δείξει ότι η σύνθεση του μικροβιώματος του εντέρου είναι ενδεικτική μιας αλλαγής στη διατροφή, το περιβάλλον ή την υγεία ενός ατόμου. Έτσι, οι επιστήμονες τροφίμων μέτρησαν ότι μια μετατόπιση του μικροβιώματος τροφίμων θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης προσμείξεων ή αλλαγών στο περιβάλλον .
Δοκίμασαν αυτή την υπόθεση με το sequencing του συνολικού RNA 31 δειγμάτων σκόνης υψηλής περιεκτικότητας σε πρωτεΐνες (HPP) που προέρχονται από το γεύμα πουλερικών. Αναγνώρισαν 119 μικροβιακά γένη και διαπίστωσαν ότι τα Bacteroides, Clostridium, Lactococcus, Aeromonas, και Citrobacter ήταν τα πιο άφθονα είδη.
«Μέσω των αλλαγών στο μικροβίωμα μπορούν να εντοπιστούν πιθανές εστίες παθογόνων παραγόντων, είτε ως αποτέλεσμα περιβαλλοντικών αλλαγών είτε σκόπιμης νοθείας», λέει η Bala Ganesan, επικεφαλής επιστήμονας μεταγενετικής και βιοπληροφορικής στο Mars Global Food Safety Center. “Αυτή η προσέγγιση αυξάνει την ορατότητα σε στοιχεία που θα μπορούσαν να αποτελέσουν απειλή για την ασφάλεια των τροφίμων και παρέχει εκ των προτέρων πληροφορίες που απαιτούνται για την ανάληψη δράσης”.
Το DNA ή RNA με sequencing, είναι ένα μοριακό τεστ και δεν είναι απαραίτητα ενδεικτικό των βιώσιμων μικροοργανισμών, οπότε συγκρίθηκε επίσης ο ποσοτικός προσδιορισμός της Salmonella στα δείγματα HPP. Δεν ήταν εμφανής η συσχέτιση μεταξύ μοριακών δεδομένων και δεδομένων από την καλλιέργεια. Παρ ‘όλα αυτά, η πλήρης αλληλουχία RNA θεωρήθηκε χρήσιμο εργαλείο για την καταγραφή της σύστασης του μικροβιώματος σε ένα δείγμα και θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για τον εντοπισμό νοθείας τροφίμων, απάτης τροφίμων και λανθασμένης επισήμανσης.
Αξιοποίηση της τεχνολογίας για το μέλλον
Καθώς οι ισχυρές τεχνολογίες, όπως το sequencing, γίνονται προσιτές για χρήση ρουτίνας, θα επωφεληθούν περισσότεροι παραγωγοί από τις βαθιές και προγνωστικές δυνατότητες αυτών των μεθόδων μοριακής ανίχνευσης. Σε συνεργασία με τη βιοπληροφορική, το sequencing DNA και RNA μπορεί να παρέχει πιο ολοκληρωμένα μικροβιακά προφίλ. Αυτά τα δεδομένα δεν είναι μόνο προγνωστικά αλλά και διαγνωστικά, επιτρέποντας στον παραγωγό να αποκαλύψει κρυμμένα προβλήματα.
Πηγή: IFT.org
Ακολουθήστε το Cibum 
